BMC出版社兽医学专业期刊发表
东纳生物快速荧光定量平台检测犬细小病毒新成果
随着分子生物学的发展，聚合酶链式反应（PCR）技术、等温扩增技术、基因芯片、探针杂交等技术已经广泛应用于微生物检测、感染性和遗传性疾病诊断、基因表达及突变检测等诸多领域的研究。然而，检测结果的判断主要依赖于传统的琼脂糖凝胶电泳检测，该方法不但耗时费力，而且由于涉及核酸染料等，安全性问题也有待提高。目前虽然逐渐出现多种核酸检测方法，然而基本受制于昂贵的仪器和试剂成本（如荧光定量PCR）或检测灵敏度不高（比色法、浊度法）等因素的限制，难以真正普及到基层和实际临床检验工作中。
近年来，磁分离已在生物测定的广泛应用，磁性微球（磁珠）成为分子细胞生物学研究、分子诊断、免疫诊断及细胞分选中极为重要的工具和核心原材料。MagBeadsTM磁性微球系列是东纳生物的明星产品，其采用经典的核壳结构设计制造，内核为聚合物微球，外层为磁性物质，最外层采用特殊聚合物修饰，具有尺寸分布均一、表面负载量高、极短的磁响应时间、高的分散稳定性等特点，可以快速、高效地从样本中分离出待测物，极大地提高检测效率。目前MagBeadsTM系列磁性微球已广泛应用于核酸提取、DNA捕获与传感技术、PCR产物纯化、测序纯化、核酸转染、抗体纯化、细胞分选、特定蛋白分离、化学发光检测、模拟酶等诸多领域，获得许多知名的大学、研究机构与临床诊断实验室研究人员的广泛好评。
图1：MagBeadsTM系列磁性微球
基于东纳生物研发团队在MagBeadsTM系列磁性微球的研究基础，东南大学生物医学工程学院研究人员与东纳生物合作开发出一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒（PCR-LFIA），使用磁珠去除PCR产物中的引物二聚体，使用荧光微球作为荧光信号放大器，确保检测的灵敏度和准确度。使用配套检测平台Nanoeasy 1700，可快速实现检测结果数字化定量。该试剂盒在保持PCR特异性的基础上，灵敏度可比普通PCR高2~3个数量级，与荧光定量PCR相当，且不涉及有毒试剂，仪器简便、易于携带，通过互联网可实时共享测试结果。PCR-LFIA检测法快速，灵敏，特异且安全，在疾病诊断、食品检验和环境微生物监测方面具有广泛的应用潜力，尤其适合即时诊断（POCT）应用。
图2：快速荧光定量检测平台Nanoeasy 1700和系列试剂盒
犬细小病毒（Canine parvovirus）感染又称病毒性肠炎、传染性肠炎，它是一种接触性、急性、高致死性的传染病。该病多呈地方性流行，发病率为60%~100%，无明显的季节性。犬细小病毒病由于其高传染性、高发病率、高死亡率，且容易误诊而错过最佳的治疗时间，从而给养犬业、宠物及一些野生动物的饲养带来了重大损失。目前实验室常用的诊断方法主要包括电镜与免疫电镜（IEM）、病毒的分离鉴定（VI）、血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）、胶乳凝集试验（LA）、间接免疫荧光试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫层析试验（ICA）、PCR法（包括普通PCR和和实时荧光PCR）等。上述方法都有各自的优点和不足。电镜和免疫电镜技术需昂贵的仪器设备和丰富的观察经验。病毒分离培养费时费力，实验条件严苛且成本较高。应用较广泛的HA和HI法，需随时准备新鲜的敏感红细胞，且对粪便样品容易误诊。ELISA和ICA法能实现病毒的快速检测，但其敏感性和准确度都有待提高。PCR诊断方法灵敏度高、特异性强，并且能够在病毒感染的早期快速检测。但PCR法需要通过凝胶电泳设备（时间长、涉及有毒试剂）或荧光定量设备（试剂、仪器昂贵）。
有鉴于此，项目组研究人员以犬细小病毒（CPV-2）为检测对象，优化出LFIA的最佳工作反应体系（100 μL）和反应时间（2 min）。结果显示，PCR-LFIA法仅检测到CPV-2，非CPV毒株均显示阴性。检测灵敏度为30 copies/μL，并且与常规PCR在临床样品中的检测结果一致（22.6％阳性，14/62），Cut-off值为146。检测结果通过Sanger测序和BLAST进一步验证。从PCR步骤开始整个过程仅需约80分钟。
研究成果发表在BioMedCentral出版社专业兽医学研究期刊BMC Vet Res（2019, 15: 30），相关成果已经申请国家发明专利。
图3：PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒（PCR-LFIA）研究示意图
图4：LFIA的工作反应体系和反应时间优化结果图. a，LFIA的工作反应体系优化（荧光成像图）；b，LFIA的反应时间优化（荧光成像图）；c，LFIA的工作反应体系优化（Nanoeasy 1700）；d，LFIA的反应时间优化（Nanoeasy 1700）
图5：PCR-LFIA检测CPV-2方法的建立. a，PCR产物纯化试剂盒在CPV-2扩增产物上的应用结果；b，快速荧光定量检测平台测试PCR产物纯化结果
图6：PCR-LFIA检测CPV-2方法的特异性测试. a，PCR结果使用琼脂糖凝胶电泳验证；b，快速荧光定量检测平台验证PCR结果
图7：PCR-LFIA检测CPV-2方法的灵敏度测试. a，PCR结果使用琼脂糖凝胶电泳验证；b，快速荧光定量检测平台验证PCR结果；c，快速荧光定量检测结果标准曲线
图8：PCR-LFIA法检测宠物犬粪便样品结果
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