东南大学生物科学与医学工程学院与南京东纳生物科技有限公司的研究者共同开发了一种简单的抗体取向结合在聚苯乙烯纳米颗粒表面的方法。
纳米探针已经在体外诊断领域得到了广泛的应用。然而在一般方法中，抗体通常是方向随机地吸附或偶联在纳米颗粒载体上，其抗原识别位点容易被占用或受到空间位阻的影响，导致纳米探针对抗原的特异性结合能力降低。为了改善抗体取向，使更多抗原结合位点充分暴露，研究者们提出了一系列新方法，代表性的技术包括利用抗体特殊位点（如Fc端寡糖链、铰链区二硫键）、引入夹层蛋白（如蛋白A、蛋白G、蛋白L）、分子印迹、抗体融合His-tag等。这些方法通常操作步骤比较复杂，成本较高，或需要对抗体改性，或需要引入新的组分，不易向实际应用中转化。
近日，东南大学生物科学与医学工程学院与南京东纳生物科技有限公司的研究者共同开发了一种简单的抗体取向结合在聚苯乙烯纳米颗粒表面的方法，即基于大家熟悉的EDC/Sulfo-NHS交联法，调整抗体和载体纳米颗粒的反应pH，并将这一条件下制备的探针用于心肌肌钙蛋白I 侧向免疫层析检测。结果表明，抗体结合量和结合取向以及抗原检测灵敏度都得到了显著提高。虽然调节pH值是优化抗体结合常用的手段,但本文首次深入探讨了该手段增强抗体取向的机制,并揭示了抗体密度、电荷分布和亲疏水性的重要性，物理吸附和化学偶联速度以及其他因素对抗体取向的影响。当pH降至略低于抗体等电点时，一方面，抗体的电荷分布和亲疏水区域分布更有利于其以“tail-on”取向；另一方面，抗体和载体间化学交联速度减缓，提供了更长的窗口时间，使抗体在纳米颗粒表面微环境的影响下更充分地调节取向。该方法提高抗体结合量的意义还在于，当抗体结合密度足够高时，抗体能够垂直紧密排列在载体表面，使探针结构更加有序和稳定。
图1 荧光免疫层析测定cTnI，探针制备时抗体投料量: (A) 50μg; (B) 200μg；(C) 抗体的三个维度尺寸
图2 (A) IgG1小鼠单克隆抗体(1IGY)的三维晶体结构。左上角:前视图;右上角:侧视图;左下角:俯视图;右下角:底部视图。碱性和酸性氨基酸基团分别用蓝色和红色标记。(B) Fab 2和Fc片段上碱性和酸性氨基酸的数量。(C)(Fab)2和Fc片段在不同pH下的净电荷量，忽略保守的糖链，电荷分布与pI的实测值不完全一致。
图3 pH对抗体取向偶联的影响及机制
这一简单、实用的方法适用于优化各种IgG型抗体的取向。充分探讨在化学交联过程中影响抗体取向的因素，也有助于更好地指导我们调节实验条件，从而构建更高性能的探针，从而实现高性能的体外诊断试剂开发。
文献链接：
Doudou Lou, Lu Ji, Lin Fan, Yongxin Ji, Ning Gu, and Yu Zhang, Antibody-Oriented Strategy and Mechanism for the Preparation of Fluorescent Nanoprobes for Fast and Sensitive Immunodetection, Langmuir 2019, 35, 4860−4867
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