产品应用案例|等温扩增联合荧光免疫层析实现沙门氏菌的快速定量检测
日期：
2022-10-19
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产品应用案例|等温扩增联合荧光免疫层析实现沙门氏菌的快速定量检测
沙门氏菌是引起重大公共卫生关注的人畜共患病病原体，据不完全统计，沙门氏菌每年在全球造成估计高达13亿人的胃肠道感染。通常情况下，沙门氏菌的感染源是受污染的食物或水。
传统的沙门氏菌检测方法主要为细菌分离鉴定，结合血清学分析。基于培养方法，可区分2600多个血清型，并可提供分离株进行药敏试验，然而通常需要耗费5-7天，繁琐且耗时，而且不同种类的肠杆菌科之间可能会发生交叉生化反应。横向流动免疫分析（lateral flow immunoassays，LFIAs）比色法方便简单，可以根据色差读出定性结果，但定量评估往往不准确，无法对测试结果进行可靠的量化表示。此外，基于琼脂糖凝胶电泳法的常规分子检测方法，如PCR和等温扩增分析，检测时为了显示凝胶上的扩增产物，使用溴化乙锭等荧光染料，会对实验者的健康构成潜在的威胁。实时定量PCR（qPCR）不需要使用凝胶电泳法，但由于其设备和试剂的昂贵而没有得到广泛应用。为了能够在现场或无仪器条件下进行检测，Linlin Zhuang等开发了一种基于链交换扩增（strand exchange amplification，SEA）和LFIAs的快速、稳定的分析方法SEA-LFIA（lateral flow fluorescent immunoassay combined with strand exchange amplification），用于沙门氏菌的定量检测（图1）。该方法应用磁珠（购自东纳生物）对基因组DNA进行快速、高效地提取，提取过程可以在30分钟内完成；使用功能化纳米颗粒作为信号放大器，大大提高LFIA荧光传感的灵敏度；使用LFIA传感器Nanoeasy 1700（购自东纳生物）和荧光成像仪（购自东纳生物）量化结果，没有假阳性或阴性，能够快速、特异地检测沙门氏菌，有望成为现场检测食源性病原菌的有效方法。
图1：SEA-LFIA法检测沙门氏菌的图示。
本文重点
1. SEA-LFIA方法的建立和优化
Linlin Zhuang等针对目前为止沙门氏菌中发现的最保守的菌毛操纵子之一的bcfc基因保守区设计了一对特异性引物（P1：GTATTGCATGGAGCGTTTCTT和P2：GCCTGCGGATTTGTTATTGT），扩增片段为44 bp。PrimerBLAST程序分析表明，所设计的引物与沙门氏菌的同源性为100%，与非沙门氏菌的相似性较低。根据引物的Tm值和BST DNA聚合酶的最适温度，以肠炎链球菌ATCC13076的基因组DNA为目标，确定61℃反应25 min为SEA的最佳反应条件。在优化SEA反应条件的基础上，Linlin Zhuang等建立了肠炎链霉菌（S.enteritidis）ATCC13076阳性样品和阴性样品（E.coliATCC25922）基因组DNA的SEA-LFIA检测方法，并对其稳定性进行了检验。LFIA传感器Nanoasy 1700显示，只有阳性样品在T线上显示出特征扩增峰，而阴性样品没有。定量结果显示，阳性样品的荧光值在34718~40539之间，变异系数为0.06。阴性样品的荧光值在4~12之间，变异系数为0.28。相应地，阳性样品在T线和C线上都显示出亮带，而阴性样品只在C线上显示出亮带。（图2）
图2：沙门氏菌SEA-LFIA检测方法的建立。(A)使用Nanoasy 1700读取以阳性样品为模板的SEA荧光值。(B)与(A)相同的样品所对应的T线和C线的荧光图像。(C)使用Nanoasy 1700读取以阴性样品为模板的SEA荧光值。(D)与(C)相同的样品所对应的T线和C线的荧光图像。
2. SEA-LFIA方法检测沙门氏菌的特异性
为了验证SEA-LFIA方法的特异性，该研究选用了18株沙门氏菌参考菌株和15株非沙门氏菌参考菌株(不同属)进行检测。结果表明，只有沙门氏菌菌株在测试线上显示出特征扩增峰，而非沙门氏菌菌株和阴性对照没有显示出扩增峰。（图3）
图3：SEA-LFIA法检测沙门氏菌和非沙门氏菌标准菌株的特异性验证。所检测的18个沙门氏菌参考菌株均出现了特征扩增峰，而15个非沙门氏菌参考菌株和阴性对照均未出现特征扩增峰，可知SEA-LFIA法具有良好的特异性。
3. SEA-LFIA法检测沙门氏菌的灵敏度
为评价SEA-LFIA检测沙门氏菌的灵敏度，Linlin Zhuang等以人工添加沙门氏菌的生鸡样品中提取的细菌基因组DNA为模板进行检测，浓度范围为3×107CFU/25g~3×100CFU/25g。结果表明，在3×104CFU/25g浓度下，特征扩增峰清晰可见，但在浓度降至3×103CFU/5g时，特征扩增峰消失。作为LFIA的质控，C线上有明显的荧光信号，说明定量结果是有效的。SEA-LFIA方法在未浓缩样品中的灵敏度与基于LAMP的生物发光方法相似，在已报道的基于核酸扩增检测沙门氏菌的研究中，加标实验的检测范围为104CFU/25g~108CFU/25g。本研究中，SEA-LFIA方法对人工添加的生鸡肉的检测限为3×104CFU /25g，与以往的研究相当。
图4：SEA-LFIA法检测沙门氏菌的灵敏度验证。检测对象为人工接种沙门氏菌的生鸡肉，模板浓度为3×107CFU/25g至3×100CFU/25g。由图像可知，SEA-LFIA法对人工生鸡肉的检测限为3×104CFU/25g。
4. SEA-LFIA法检测沙门氏菌的准确性
将SEA-LFIA检测沙门氏菌的方法，与传统的培养方法和凝胶聚合酶链式反应（Gel-Based PCR）进行比较。在采集的236份样本中，37份（16%）经SEA-LFIA检测呈阳性，分别从生肉（19%，23/118）、生奶（15%，5/33）、水产品（10%，4/39）和腐肉制品（11%，5/46）中检出。SEA-LFIA的临界值（阴性样品的平均值加上3倍标准差）为15，Gel-Based PCR法检测结果与SEA-LFIA法一致。传统培养方法检出沙门氏菌32份，SEA-LFIA检测结果为阳性。另外5份可疑样本（3份来自生肉，1份来自生奶，1份来自焦炭制品）经PCR扩增后DNA测序呈阳性。在多个样本中的检测结果与以往的报道一致，也证明了基于核酸的检测方法的准确性优于传统的培养方法。
图5：对236份样本进行SEA-LFIA法沙门氏菌检测，“◆”和“◇”分别表示阳性和阴性结果，37份样本（16%）经SEA-LFIA检测呈阳性，荧光值远高于阴性样本。
表1：对236份样本进行SEA-LFIA、传统培养方法和PCR-凝胶电泳法沙门氏菌检测的检测结果。
总结与展望
综上所述，本工作开发的SEA-LFIA方法对沙门氏菌的检测具有优良的特异性和灵敏度，从经济角度来看，该研究中的SEA-LFIA方法在试剂和耗材成本上与基于凝胶的PCR相似，但它消除了对安全性较低的电泳实验和昂贵设备的需要，并且SEA-LFIA法只需28分钟即可完成检测，远远少于基于凝胶的PCR所需的时间（2-3小时），而且SEA-LFIA每次检测的样本数量不受限制。因此，考虑到经济、时间和人力成本，SEA-LFIA法在批量检测、现场检测和无仪器条件下具有明显的优势，有望成为现场检测食源性致病菌的有效方法。Zhuang L, Gong J, Ji Y, et al., Lateral flow fluorescent immunoassay based on isothermal amplification for rapid quantitative detection of Salmonella spp. Analyst. 2020, 145(6): 2367-2377.
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