Biosens. Bioelectron.普鲁士蓝纳米酶成功用于纸基比色葡萄糖传感
日期：
2022-11-10
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Biosens. Bioelectron.普鲁士蓝纳米酶成功用于纸基比色葡萄糖传感
近日东南大学顾宁院士团队与基蛋生物科技股份有限公司合作成功将普鲁士蓝纳米酶应用于纸基比色葡萄糖传感。利用普鲁士蓝纳米酶代替天然HRP，与天然GOD协同催化级联反应，可以有效节省成本；结合手持式检测设备，实现了在2.5 mM到25 mM的校准线性范围测量对实际血液样本中葡萄糖浓度精确测量，并表现出良好的重现性、热稳定性，以及与市售葡萄糖试纸条检测结果的相关性，展现出巨大的应用潜力。研究工作以“Paper-based colorimetric glucose sensor using Prussian blue nanoparticles as mimic peroxidase”,为题发表在国际著名期刊Biosensors and Bioelectronics，博士生童鎏为文章的第一作者，顾宁院士与苏恩本教授为文章的共同通讯作者。
一、研究背景
对人体血液中葡萄糖、尿酸、肌酐、胆固醇等代谢物的定量检测对于评估糖尿病、慢性和急性肾损伤和血脂异常等慢性疾病的进展和治疗效果具有重要意义，然而慢性病的评估需要频繁的生化检测。对于可被特定氧化酶催化生成过氧化氢的代谢物，实验室内往往利用一种名为Trinder反应的传统比色法进行检测。然而，这种检测往往需要繁琐的设备、繁琐的样本采集和专业的操作。作为替代方案，基于纸张的比色传感器（干式生化试纸条）结合小型手持设备可以实现对全血小分子生化物质的快速测量。
目前工业生产的试纸条主要采用天然辣根过氧化物酶（HRP）催化由前置步骤中氧化酶催化底物生成的过氧化氢。然而，天然酶在恶劣条件下（如强酸度、高温）容易失活，同时其提取、纯化过程复杂，导致生产成本高昂。普鲁士蓝纳米颗粒（PBNPs）作为一种天然过氧化物酶的有力替代品，在干燥环境中依然能够表现出良好的模拟酶活性，加之其低成本的合成方法和较高的生化稳定性，是一种有效的天然酶替代方案。1.负载PBNPs试纸条（PB-PS）的制备及葡萄糖检测原理
PB-PS的制备过程如图1（A）。利用喷膜仪将溶有葡萄糖氧化酶、PBNPs（来自东纳生物）和显色底物（4-AAP和MAOS）的缓冲液以一定移动速率和流速均匀喷涂在反应层膜材上，烘干后将其粘贴在PVC板上。之后将表面活性剂处理过的过滤层和聚酯扩散层依次层叠，形成“三明治”结构，利用裁条机切割成5 mm宽的长条，最后将其放入专门的塑料卡壳中进行后续检测。
图1 PB-PS的(A)制备工艺流程及(B)检测原理示意图
PB-PS的检测原理如图1（B）。血液样本滴加在试纸条表面后，扩散层能够快速均匀地将液体向四周扩散并下渗，有利于缓解因液体扩散不均导致的咖啡环效应。通过扩散层后，均匀分布的血液渗透到过滤层中。过滤层用于分离血细胞，仅使血浆流到反应层进行显色。过滤层提前浸泡在溶有氯化钠和山梨醇的缓冲液中，可以增加亲水性，并防止溶血对显色信号造成的干扰。血浆充分过滤最终到达底部试剂层，葡萄糖在葡萄糖氧化酶（GOD）的催化下被氧化产生过氧化氢，PBNPs通过Trinder反应催化N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐（MAOS）氧化，并与4-氨基安替比林（4-AAP）反应，形成蓝紫色物质，该物质的紫外-可见光吸收峰在635 nm左右。作者还开发了配套的手持检测系统（图2），加载血液的PB-PS可通过该设备检测反射率信号，依据反射信号强弱计算对应的血糖浓度。
图2 手持检测系统使用示意图
2.PB-PS制备工艺优化
由于膜处理液配方的复杂性，同时为了保持制备工艺的稳定，作者依次对PB-PS制备过程中的多个参数进行优化（图3）。pH优化结果（图3A）表明在pH 4.0处有一个明显的反射率峰值，说明在该pH条件下达到了最大的催化效率。Triton X-100作为表面活性剂可以提高纸基质的润湿性，并稳定反应过程中形成的蓝色化合物，当Triton的浓度为0.1%时，显色重复性最好（图3B）。Gantrez作为一种生物黏附剂，帮助物质结合在试剂层上，当Gantrez的浓度达到5%时，PB-PS可以保持其检测功能达4周以上（图3C）。在反应层喷涂速率达5.5 μL/cm，37℃干燥60 min时，PB-PS可以实现较为均一的强显色信号。
此外，为了平衡显色效率和生产成本，作者也对喷涂溶液中PBNPs浓度，GOD浓度与显色底物浓度分别进行了优化，选取0.8 mg/mL 的PBNPs，400 kU/mL的GOD，4g/mL的MAOS和4-AAP为最优配方。
图3 (A) 在pH为2，3，4，5，6条件下制备的试剂层，采用5.2 mM葡萄糖的血液样本测量的反射率结果；(B) 在Triton X-100浓度为0%，0.05%，0.1%，0.15%条件下制备试剂层，使用5.6 mM葡萄糖的血液样本测量的反射率结果；(C) 45ºC储存条件下30天内不同浓度的Gantrez（0%，1%，5%，10%）处理的PB-PS反射率变化；(D) 以3.5，4.5，5.5，6.5，7.5 μL/cm喷膜速率制备的试剂层，采用25.0 mM葡萄糖的血液样本测量的反射率结果；(E) 在37 ℃和45 ℃下干燥的试剂层，使用5.7 mM葡萄糖的血液样本测量的反射率结果；(F) 37 ℃下干燥15，30，60，90 min的试剂层，采用5.7 mM葡萄糖的血液样本测量的反射率结果。（所有的血糖浓度在实验前均已采用Accu-Chek试纸条测定。）
3.PB-PS性能评价及血糖检测应用
在性能评价中作者首先测量了优化后的PB-PS的标准曲线（图4B），PB-PS在反应后第180 s的反射率对不同浓度的葡萄糖样本在2.5~25 mM内有良好的线性关系，相关系数大于0.99。线性方程为反射率=1.639 + 0.019×[C(葡萄糖)(mM)]，检测限（LOD）达0.13 mM。
结果表明优化后的PB-PS也具有优越的重复性和热稳定性：以2.8，5.6，7.8和16.5 mM作为质控浓度评估PB-PS的重复性，其对应变异系数（CV）分别4.4、3.1、2.8和3.7%；将而PB-PS在45ºC环境中放置一个月，其测试结果与第一天的读数相比无明显变化。
图4 (A) 对不同浓度葡萄糖产生反射信号强度的时间曲线；(B) 标准曲线，误差棒表示标准差（n = 3）；(C) 不同浓度葡萄糖样本检测后的PB-PS实际图片。
在图5A中研究了PB-PS对果糖、乳糖和麦芽糖的选择性，由于GOD的高选择性，表面PB-PS对葡萄糖有良好的特异性。最后，作者利用优化后的PB-PS测量了115份葡萄糖浓度在2~25 mM的血液样本。如图5B所示，PB-PS与商业试纸条的检测结果具有较好的相关性。对于超过90%的样本，两种方法的检测结果的百分比偏差均小于10%。
图5 (A) PB-PS的选择性。所有葡萄糖及其类似物样本都在5.6 mM下测量三次。(B) PB-PS与Accu-chek检测结果对115个样本的相关性。1.开发设计了一种纸基比色葡萄糖传感器PB-PS，利用PBNPs代替天然HRP，与天然GOD协同催化级联反应，可以有效节省成本。
2.通过对膜处理液配方，喷涂速率，干燥温度和干燥时间进行优化，实现了在2.5 mM到25 mM的校准线性范围测量对实际血液样本中葡萄糖浓度精确测量，并表现出良好的重现性、热稳定性，以及与市售葡萄糖试纸条检测结果的相关性。
3.所开发的PB-PS可以作为一种成熟的POCT产品进行工业化批量生产。原则上，通过简单地改变氧化酶，该设备可以应用于其他多种生物标志物检测（如尿酸、肌酐、胆固醇等）。由于配合手持检测装置使用，PB-PS可以实现自动读取数值，并存储至云端等功能。在临床应用，特别是家庭和社区层面的医疗场景中展现出巨大的应用潜力。
Liu Tong a, b , Lina Wu b , Yunfeng Zai b , Yu Zhang a , Enben Su b, * , Ning Gu a, *，Paper-based colorimetric glucose sensor using Prussian blue nanoparticles as mimic peroxidase, Biosensors and Bioelectronics, https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114787http://www.nanoeast.net/prod_view.aspx?TypeId=212&Id=335&Fid=t3:212:3
普鲁士蓝纳米颗粒
http://www.nanoeast.net/prod_view.aspx?TypeId=182&Id=286&Fid=t3:182:3
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