随着农业和医学中抗生素的过度使用，多重耐药（MDR）细菌已经成为全球人类健康的主要危害。此外，由于可用的药物治疗方案有限，造成了额外的负担。因此，迫切需要开发有效的早期鉴别方法，以确保迅速消除MDR细菌。
迄今为止，已经开发了多种用于临床检测MDR细菌的方法。传统的基于培养的生化检测易受感染风险，且通常需要几天的时间，进而导致治愈过程和疾病控制的延迟，但仍是细菌学领域的黄金标准。基于聚合酶链式反应（PCR）方法的大规模应用受到多种因素的制约，如需要专业操作、清洁环境以及缺乏高通量操作。因此，亟需一种快速、灵敏的方法来高效检测低丰度MDR细菌。
为了解决这一问题，研究人员将免疫磁分离（IMS）与基于金纳米粒子（GNP）的动态光散射（DLS）技术和荧光技术配合使用，MDR细菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）首先被AptMBs（适配体功能化标记羧基磁珠，磁珠选自南京东纳生物科技有限公司）特异性捕获并分离，随后，引入适配体-探针双链体修饰的GNP（AptGNP）来识别收集的靶标并形成“AptGNP包被细菌”复合物，而AptGNP从分散到聚集的状态变化引起快速且超灵敏的DLS信号变化，同时，目标 MDR 细菌释放探针，呈现出阳性荧光信号，充当“关闭到开启”的荧光纳米开关。结果表明，所提出的双模式适配体传感平台（DAPT）可以实现MRSA的超灵敏检测（LOD：4.63 CFU mL−1）。（研究工作发表在Biomater. Sci., 2023, 11, 1754–1764 IF：6.6）。
图1. DAPT检测MDR细菌的机理示意图。
本文重点：
1.本研究工作中，研究人员通过TEM、粒径分布、Zeta电位、XPS和FT-IR证明了AptGNPs的成功合成，加入MRSA后，荧光强度的显著增加证明了荧光模式检测的可行性。
图2. AptGNPs颗粒的基本性能分析。
通过TEM观察AptGNPs的颗粒大小和形貌。所制备的AptGNPs分散性好，平均粒径为135.3±5.8 nm，与GNPs相比，AptGNPs具有稍大的流体力学直径，这证实了GNPs表面适配子的成功修饰。Zeta电位的测量结果表明，AptGNPs的Zeta电位显著高于GNPs，证实负电荷的适配体已成功修饰在GNPs的表面。通过XPS和FT-IR光谱对GNPs和AptGNPs的表面化学成分和官能团进行了评估。此外，可以忽略的粒径和荧光变化，显示出AptGNPs良好的稳定性。BHQ2标记的适配体导致荧光处于“off”状态，然而，MRSA (104 CFU mL−1) 替换 cy5 标记的探针时，荧光显示为“on”状态，即在加入MRSA后，观察到峰值荧光强度有明显的上升趋势，表明探针已成功释放。
2.研究人员首先对DAPT的实验条件进行优化，随后在DLS模式下对DAPT的运行性能进行研究，包括检测范围、检测限、特异性、重现性及真实样本的检测。
研究人员对MB上修饰的适配体数量和捕获时间等实验参数进行优化。捕获效率随适配体用量的增加而逐渐增加，当浓度超过1.5 mM时，捕获效率趋于平稳，捕获的细菌随着培养时间的增加而增加，20 min后捕获的目标菌数达到90%以上。琼脂板照片表明磁捕获MRSA之前和之后的显著差异。TEM图像表明，AptGNPs可以选择性地与细菌结合形成“AptGNPs包被细菌”复合体，而AptGNPs的状态也随之从分散变为聚集。将AptGNP 与不同浓度的MRSA一起孵育，会导致AptGNP的平均DH出现明显的浓度依赖性增加。AptGNP 探针的平均DH与MRSA 浓度（从6 ~ 6×104 CFU mL−1）具有良好的线性关系（R2 = 0.9943），线性回归方程为：y = 9.5154 ln(x) + 137.54，其中y表示AptGNP的DH，x表示MRSA的浓度，LOD 为 4.63 CFU mL−1。在该模式下进行特异性和重现性验证，并在盐水和牛奶中进行加标回收实验，结果显示，盐水中的样品回收率为91.90% ~ 102.77%，牛奶中的样品回收率为95.00% ~ 99.40%。3.研究人员在荧光模式下对DAPT的运行性能进行研究，包括检测范围、检测限、特异性、重现性及真实样本的检测。由于DLS模式在高浓度细菌下易受到干扰，因此荧光模式可以作为DLS模式的有效补充。荧光图像显示，荧光强度随着MRSA的浓度（10 CFU mL−1 ~ 106 CFU mL−1）的增加而增加，荧光强度与MRSA的浓度具有较好的线性相关拟合Y = 139.5X + 253.7（R2 = 0.9879），其中X和Y代表MRSA的浓度的对数和峰值荧光强度，LOD 为 13.42 CFU mL−1。DLS模式和荧光模式相互补充，弥补了单一模式检测性能的不足。在该模式下进行特异性和重现性验证，并在盐水和牛奶中进行加标回收实验，结果显示，盐水中的样品回收率为 97.41% ~ 101.10%，牛奶中的样品回收率为 96.30% ~ 99.43%。4.通过与传统培养方法进行比较，进一步证实了DAPT策略鉴定临床MRSA感染样本的能力。图5. 用临床样本比较传统培养方法与DAPT策略鉴定临床MRSA感染样本的能力。菌落图像表明，在阳性样本（样本1-7）中可以清楚地观察到细菌增殖，而阴性样本（样本8-10）在培养板上没有表现出增殖，此工作所阐述的DAPT 策略验证了临床阳性和阴性样本之间 DLS 信号和荧光强度的显著差异。计算阴性样本的平均值加上三个SD（95％置信水平）以确定双模式的阈值，与培养方法相比，所提出的DAPT策略实现了菌落计数结果 100% 的准确性。此外，受试者工作特征曲线（ROC）的曲线下面积（AUC）为1.00，揭示了DAPT方法的高预测能力。5.研究人员分别对MDR大肠杆菌、结核分枝杆菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的相应序列（包括适配体和探针）进行了重新编程，以验证DAPT检测平台区分其他MDR细菌的通用性。四种模式中，超过92%的MDR细菌可以在25分钟内被捕获和分离，识别和检测过程可以在35分钟内完成，DAPT系统检测MDR细菌的通用工作流程可以在60分钟内完成。四种不同类型的 MDR 细菌交叉验证临床样本实验表明，只有相应的MDR细菌才能激活荧光强度并诱导粒径增加。DLS 信号和荧光强度都随着细菌浓度的增加而呈现出成比例的变化，表明该检测平台对其他MDR细菌的通用性通过以上实验，研究人员成功开发了一个通用的DAPT平台，用于超灵敏和准确地检测临床样本中的MDR细菌。所提出的DAPT策略的优越性主要取决于其两种模式的协同效应：（i）DLS模式，它能够时实现超高灵敏度的精确检测，LOD为4.63 CFU mL−1，以及（ii）荧光模式，它是高浓度下可靠定量的有效补充。DAPT方法在概念验证实验和临床分析实践中都表现出出色的分析性能，包括准确性、选择性、重现性和可靠性。此外，DAPT平台显示出成为通过重新编程相应序列来区分各种MDR细菌的通用工具的巨大潜力。
[1] Zhao F, Zou M, Wu H, et al. A simple and programmable dual-mode aptasensor for the ultrasensitive detection of multidrug-resistant bacteria[J]. Biomaterials Science, 2023, 11(5): 1754-1764.更多研究内容请关注网站http://www.nanoeast.net/新闻。Nanoeast是生物医用磁性微纳米材料的专业制造商，将为您提供多种纳米产品，助力纳米科技转化应用研究。