产品应用案例│扬州大学周昕教授报道基于金纳米探针散射对单个肺炎衣原体进行裸眼计数的方法
肺炎衣原体，直径约200 nm的球形颗粒，是一种专性细胞内寄生微生物。肺炎衣原体不仅能引起人感染，还能广泛引起各种动物如爬行动物、两栖动物、马和考拉感染。肺炎衣原体也是呼吸道感染社区传播的重要来源之一，最近研究表明肺炎衣原体和各种慢性疾病，如老年痴呆症、哮喘、肺癌、心血管疾病相关。因此，迫切需要发展准确、超灵敏的肺炎衣原体检测方法。目前对于肺炎衣原体的检测方法主要包括培养寄主细胞，用显微镜分离观察，聚合酶链反应（PCR），以及微量免疫荧光检测。这些方法耗时、极度依赖于操作者的经验、容易受到其它衣原体交叉感染的影响，存在假阳性干扰的风险。扬州大学周昕教授课题组发展了一种基于金纳米粒子（购于东纳生物）的局域表面等离子共振（LSPR）产生的散射光特性，在暗场显微镜下对肺炎衣原体进行裸眼计数的方法（ACS Sensors, IF 7.711 ）。将抗肺炎衣原体抗体标记15 nm Au纳米粒子形成Au纳米免疫探针（GNP探针），数百个GNP探针特异性识别肺炎衣原体形成环状结构，发出强散射光，在暗场显微镜下很容易通过肉眼观察识别单个肺炎衣原体。GNP探针是通过DNA单链修饰抗体和DNA单链修饰Au纳米粒子杂化形成，具有很高的稳定性及特异性。通过GNP探针标记和暗场显微镜观察，肺衣原体检测的最低检测限可以达到4个/微升，比荧光定量PCR（qPCR）更灵敏4倍，且可在30分钟内完成检测，这为基础感染性病原体早期现场检测提供了一种快速、低成本、易操作的的方法。
图1：GNP探针标记，暗场显微镜观察肺炎衣原体流程图。在这里GNP探针是通过DNA3/DNA2修饰的Au纳米粒子和DNA1修饰肺炎衣原体抗体杂交形成。含有肺炎衣原体的样品用GNP探针标记20分钟，就可以用暗场显微镜进行观察。
本文重点
（1）采用单链DNA1（5’-TTTATATAGAGGAGTTTTTTTTTTTT-C3-SH-3’）标记抗体和单链DNA3（5’-CTCCTCTATATAAATTTTTTTTTTTTC3-SH-3’），DNA2（5’-TTTTTTTTTT-C3-SH-3’）混合标记Au纳米粒子杂交形成GNP探针。紫外显示Au纳米粒子在修饰上DNA和DNA标记抗体后，最大吸收有微弱的红移，水动力尺寸增大，且Zeta电位负移。采用SDS-PAGE电泳对GNP探针分析可以证实肺炎衣原体抗体通过DNA杂交成功偶联在Au纳米表面，在电泳图上出现~55kDa抗体重链条带以及~20kDa的抗体轻链条带。而Au-DNA，或Au纳米粒子的电泳图上并不会出现任何条带。TEM图显示GNP探针的单分散性极好，与Au或Au-DNA类似。
图2：Au纳米免疫探针表征。（A）紫外，（B）水动力尺寸，（C）Zeta电位，（D）SDS-PAGE电泳，（E，F，G）Au纳米粒子，Au-DNA纳米粒子，GNP探针TEM图。
（2）筛选了肺炎支原体GNP探针的最佳浓度，并且验证了GNP探针对肺炎衣原体的特异性。将GNP探针与肺炎衣原体、DT104沙门氏菌和O78大肠杆菌共孵育。TEM图像显示肺炎衣原体外富集了数百个GNP探针（图3A），但是未采用抗肺炎衣原体抗体标记的Au纳米粒子并不能特异性识别肺炎衣原体（图3B）。同样肺炎衣原体GNP探针也不能识别DT104沙门氏菌和O78大肠杆菌，这说明肺炎衣原体GNP探针具有很高的特异性。
图3：TEM图像验证GNP探针特异性。（A）GNP探针围绕肺炎衣原体。（B）未偶联肺炎衣原体抗体的Au纳米粒子与肺炎衣原体混合。GNP探针与DT104沙门氏菌（C）和O78大肠杆菌（D）孵育。
（3）研究了GNP探针标记，暗场显微镜观察方法对肺炎衣原体检测的最低检测限（LOD）和捕获效率。作者首先采用PCR方法对肺炎衣原体样品进行定量，随后采用GNP探针标记和暗场显微镜观察方法对不同稀释样品进行计数。结果显示在本研究中，qPCR对于肺炎支原体的LOD为15 拷贝/微升，而GNP探针标记，暗场显微镜计数方法的LOD比qPCR要灵敏4倍。另外，GNP探针对肺炎衣原体的捕获效率高达95%以上，阳性样品中几乎每一个病原体都被几百个GNP探针围成花环状，很容易在暗场显微镜下进行观察。而在对照阴性样品中，完全观察不到GNP探针。
（4）用GNP探针标记，暗场显微镜观测方法检测肺炎衣原体感染组织样本。对感染肺炎衣原体3天的老鼠肺部样本用GNP探针标记，暗场显微镜观测发现：肺炎衣原体感染的样品很容易被观察，并且能够定量评估出肺炎支原体的数量，计数结果与qPCR和数字PCR（dPCR）进行对比，偏差在5%之内。
图4：GNP探针标记，暗场显微镜观测动物组织中的肺炎衣原体。（A）来自于老鼠肺部的肺炎衣原体的TEM图，（B）GNP探针捕获的老鼠肺样本的肺炎衣原体的TEM图，（C）GNP探针捕获的老鼠肺部组织肺炎衣原体的暗场显微镜图，（D）采用GNP探针标记，暗场显微镜观察计数与采用qPCR和dPCR计数的柱状图比较。
总结：
病原体的早期检测是预防医学的重要问题。大多数微米大小的病原体可以在普通光学显微镜下进行临床鉴定。但对于大小约200 nm的病原体，如肺炎衣原体这类常见致病微生物的光学显微镜检测仍然是一个挑战。在本研究中，作者提出了一种GNP标记，暗场计数法准确定量肺炎衣原体的方案。作者通过DNA偶联抗体和DNA偶联Au纳米粒子的杂交制备稳定和高特异性的GNP探针，在肺炎衣原体外构建花环一样的结构，Au纳米粒子LSPR效应产生的散射光使得肺炎衣原体很容易在暗场显微镜下被观测到。采用GNP标记，暗场显微镜观测的方法测得的肺炎衣原体LOD为4个病原体/微升样品，比qPCR要灵敏4倍。一旦DNA和抗体偶联的GNP探针制备完成，只需要一步混合，一步离心，以及一滴样品用于计数，便能够方便地对肺炎衣原体进行计数，这种简便有效的方法很适合应用于欠发达地区的传染病防控工作中。
参考文献:
F. L. Chen, T. Di, C. T. Yang, T. Y. Zhang, B. Thierry, X. Zhou, Naked-Eye Enumeration of Single Chlamydia pneumoniae Based on Light Scattering of Gold Nanoparticle Probe., ACS Sens. 2020, 5, 1140−1148.
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