应用案例│东纳MagBeads® TiO2磁珠助力纯化血浆细胞外囊泡用于糖尿病视网膜病变研究
具有规律性波动的细胞外囊泡（EVs）载体可为临床诊断和预后提供预判。血浆样本是循环EVs最重要的来源之一。然而目前EVs分离技术主要为超速离心法、超速密度梯度离心法、聚合物沉淀法、免疫亲和法、超滤法、尺寸排阻色谱法等。血浆EV分离具有较高的技术壁垒和成本消耗，限制其在疾病诊断和生物标志物发现的应用。最近，来自温州医科大学的潘优津、陈途灿等人采用Fe3O4@TiO2磁珠（购自东纳生物，货号MBTi-B）提取血浆小细胞外囊泡sEVs，工作发表在Anal.Chem.（IF=8.008）上。Fe3O4@TiO2磁珠粗糙岛状的TiO2表面具有尺寸排阻效应，可增强结合点，通过膦脂亲和力，有效可逆地捕获sEVs。与超速离心方法相比，整个过程小于20分钟，并且可以从100 mL血浆样品中提取约108 sEVs。对糖尿病视网膜病变（DR）疾病过程中sEVs的代谢变化进行研究，发现了一组显著的代谢产物量的提高，这预示着sEVs的代谢波动与糖尿病视网膜病变发病和发展相关。这样一个灵活可放大的EVs捕获系统能成为以血浆为基础的液体活检的有效分析工具。 图1：Fe3O4@TiO2磁珠用于血浆sEV分离及下游分析的示意图
本文重点：
TiO2磁珠通过和sEVs双层磷脂的磷酸基形成双齿结构捕获sEVs，磁性内核能进一步将磁珠-sEVs复合物从非sEVs混合物如可溶性蛋白中分离。磁珠和EVs的结合是可逆的，通过碱性溶液清洗，便能洗脱和收集所捕获的sEVs。TiO2磁珠的结构及用量将影响外泌体的提取。光滑表面的TiO2磁珠和岛状结构的TiO2磁珠均能提取sEVs，但岛状结构TiO2磁珠显示出更高外泌体的提取量及更低白蛋白的污染量。
图2. TiO2磁珠有效分离血浆-sEVs条件最优化选择。
将TiO2磁珠提取sEVs的分离方法与常规超速离心（UC）及尺寸排阻色谱法（SEC）相比较。通过NTA的粒子数及尺寸分布表征，透射电镜（TEM）的形貌表征以及特定蛋白如CD63、TSG101、APOE、APOA1、Calnexin的蛋白印记（WB）表征，TiO2磁珠提取法可获得纯度和数量高于SEC分离法，类似于UC法分离的sEVs，却大大缩短了时间，并且不会引起蛋白质聚集和对EVs的破坏。
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病（DM），尤其是2型糖尿病（T2DM）最常见的微血管并发症。DR会导致全球范围内工作年龄成年人的明显视力丧失。根据糖尿病进展过程中的视网膜微血管征象，DR在临床分为两类：早期的非增生性DR（NPDR）以及晚期的PDR。大约7%的糖尿病患者会发展为PDR，并有严重的视力威胁风险。糖化血红蛋白（HbA1c）是DR诊断的生物标志物，却依赖于熟练的影像诊断，且仅大约6.6%的视网膜病变可由HbA1c解释。因此，筛选早期特征对DR的预防和治疗具有特别重要的意义。采用TiO2磁珠对健康对照（HC）、糖尿病（DM，没有DR的T2DM）、早期非增生性NPDR及晚期PDR人群的血浆样本进行提取分析并进行posthoc Dunn's pairwise多重比较。结果发现HC组与DM或NPDR组有明显的粒子数统计区别。然而，NPDR和DM或PDR之间并没有显著差异。
图4. TiO2磁珠促进DR的下游代谢谱分析研究。
采用高效液相色谱串联电喷雾质谱法（LC-ESI-MS）对TiO2磁珠所提取的sEVs的化学信息进行分析，共检测出344种代谢物，包括有机酸及其衍生物、氨基酸、苯及其取代基衍生物、醇、胺、杂环化合物、核苷及其衍生物、醛、酮、酯等。另外脂类亚类（如甘油磷脂、脂肪酰基、甘油脂和鞘脂）也能被检测到。对所有组进行OPLS-DA（正交偏最小二乘判别分析）发现DR（NPDR和PDR）与非DR（DM和HC）之间有明显的区别，这暗示着在DR或早期DR阶段会发生新陈代谢异常。本研究提出了一种采用TiO2磁珠对血浆中sEVs进行纯化的方法，从sEVs角度分析DR的代谢变化。研究证实了粗糙壳层的TiO2磁珠可在20分钟内快速从血浆中分离sEVs，其产量和纯度均与“黄金标准”UC相似。在临床应用中，使用TiO2磁珠从DR受试者中分离血浆sEVs，深入研究疾病所引起的代谢波动。研究表明在DR群中，代谢产物簇水平显著升高，这暗示着sEV代谢对判断DR的发生和进展有潜在作用。
参考文献：Pan Y. J., Chen T.C., Zhang Q. W., et. al., Highly Selective Purification of Plasma Extracellular Vesicles Using Titanium Dioxide Microparticles for Depicting the Metabolic Signatures of Diabetic Retinopathy., Anal. Chem. 2022, 94, 14099−14108.
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