诺奖∣念念不忘，LNP必有回响

北京时间10月2日17点48分，瑞典卡罗琳医学院宣布，将诺贝尔生理学或医学奖授予匈牙利科学家卡塔琳·卡里科和美国科学家德鲁·魏斯曼，以表彰他们在核苷碱基修饰方面的发现，使得针对肆虐全球的新冠病毒的mRNA疫苗得以成功开发。

mRNA技术运用到药物（或疫苗），就是把带有遗传信息、指导蛋白质合成的“中间分子”拿出来，使机体有目的性的合成蛋白质。但很多研究证明，要想在体外制备mRNA，使之在体内合成蛋白质，存在系列难点：其一是mRNA具有很强的免疫原性，很容易激活人体免疫系统，造成严重的炎症；其二是mRNA代谢活跃，半衰期很短，合成后数分钟至数小时即被分解；此外，分子量和负离子性质也为它进入细胞膜屏障带来了巨大阻碍。

两位获奖者的研究成果，使人们从根本上改变了对mRNA如何与免疫系统相互作用的理解。在2005年，卡塔琳·卡里科发现了一种基于mRNA修饰的技术，她将假尿嘧啶核苷引入mRNA（即用假尿苷替换尿苷），解决了免疫原性过强这一难题。2015年，德鲁·魏斯曼团队利用脂质纳米颗粒（LNP）的特性，通过构建mRNA-LNP复合物，有效帮助mRNA进入细胞。

目前，LNP已成为临床上最前沿的mRNA递送系统，且已有多款使用LNP的核酸药物获批。LNP作为mRNA的递送载体有以下优点：制剂简单、模块化、生物相容性好，且具有较大的mRNA有效载荷容量。除活性物质mRNA外，LNP通常包括四种脂质：可电离脂质、胆固醇、辅助性脂质和聚乙二醇化脂质。如图1所示，在微流控技术下，溶有脂质的溶剂和含有核酸的水溶液分别被注入芯片的两条入口通道，两股流体混合引发LNP的自组装，酸性条件下头部带正电的可电离脂质与带负电的核酸结合，疏水尾部暴露在外，再被辅助性脂质包裹，形成亲水外壳。胆固醇和聚乙二醇化脂质镶嵌其中，调节膜的完整性、刚性及纳米颗粒大小，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用增加纳米颗粒的半衰期，最终形成载核酸的脂质纳米颗粒。

图1.微流控技术生产LNP-mRNA。

LNP的测试与转染

经脂质处方优化和微流控包封工艺开发，东纳生物平台已经成功开发应用的阳离子脂质包含DOTAP等，pH响应性可电离脂质包含SM-102、DLin-MC3、ALC-0315、DLin-DMA等，核酸类型包含siRNA、质粒DNA、mRNA、sgRNA等。

含有阳离子脂质的脂质复合物用于核酸递送时，由于存在毒性和缺乏体内效力等问题，已基本被pH响应性可电离脂质所取代。生理pH下可电离脂质表现为中性，降低了细胞毒性，而在内体的酸性环境中则带正电荷，有利于细胞摄取和内体逃逸。东纳生物平台制备的LNP，纯水中的Zeta电位在0 mV左右，表明LNP在中性条件下基本不带电荷，保证了生物相容性。

将Hela细胞用RPMI-1640培养基稀释后，以1×10⁴个/孔的数量种入96孔板，以总mRNA载量计算，分别在孔中加入载0.1，0.6，1.0 μg mRNA的GFP-mRNA-LNP，共培养8 h后，加入10%胎牛血清混匀，继续共培养12 h、28 h后，倒置荧光显微镜观察，细胞转染结果如图2a。根据细胞培养结果，mRNA投料量为0.1 μg/孔时即可成功转染细胞，共培养20 h后即可观察到明显的荧光，继续培养16 h后，荧光增强。

在脂质载体作为运输载体的药物运输系统中，粒径和PDI是评价纳米载体体系质量的一项重要指标。粒径小于20 nm的纳米颗粒容易被肾脏代谢掉，且较小的脂质体具有较大的曲率，这反过来会影响识别位点的数量，粒径过大对转染效果和安全性影响都较大。目前大多采用微流控技术所制备的LNP，粒径一般分布在20~200 nm 之间。东纳生物平台所制备的mRNA-LNP包封率大于80%，粒径可控制在100 nm左右，粒度分布均匀（PDI＜0.20），如图2b和表1所示，均可达到市面高水平。